細胞凍存與復蘇的常見問題

　　細胞冷凍保存是細胞保留的主要方式之一。借助冷凍技術，將細胞置于-196℃的液氮中，可使其暫時脫離生長狀態并保持其細胞特性，以備日后在實驗中復蘇使用。這一方法不僅可以預防正在培養的細胞遭受污染或其他意外情況而導致種群喪失，同時也發揮了細胞保護的功效。那么你知道細胞凍存與復蘇的常見問題嗎？讓我們一起來看看吧！

　　一、細胞凍存為什么要添加保護劑

　　細胞凍存是將細胞放在低溫環境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術。

　　細胞在不加任何保護劑的情況下冷凍，細胞內外的水分會很快形成水晶從而引發一系列的不良反應：首先，部分蛋白質因局部電解質濃度增高和pH值改變而變性，導致細胞內部空間結構發生改變。其次，細胞內冰晶的形成和細胞膜系統上蛋白質，酶的變性等會限礙細胞的能量代謝。再次，胞膜上的類脂蛋白復合體在冷凍中易發生破壞引起胞膜通透性的改變，使細胞內容物喪失。最后，隨著冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間結構發生損傷從而引起細胞死亡。添加冷凍保護劑可以很好的改善細胞的破壞與死亡情況。

　　二、冷凍管應如何解凍

　　從液氮中取出細胞置-80℃冰箱中數分鐘，讓管中液氮控發后，再放入37℃的水浴鍋中(預防凍存管爆裂，凍存管內有液氮的話，直接放入37℃水浴鍋中可能爆裂)。

　　輕搖凍存管使其最好在2min內全部融化，并注意水面不可超過凍存管管口，否則容易造成污染。

　　三、高效進行細胞凍存應該注意什么

　　1.緩慢冷凍：慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因產生大的冰晶而受到損害。相反，細胞內若出現大結晶會引起細胞膜、細胞器的損傷和破裂。

　　2.細胞活力及濃度：細胞應在生長良好、培養瓶致密度約為80-90%、活力達90%以上的狀態下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。

　　3.凍存密度：凍存時細胞密度少于5x105個活細胞/mL時，很難成功復蘇。

　　4.凍存管蓋子：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

　　5.凍存時間：細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議在-80℃冰箱中的保存時間不要超過48h（一般只需要12小時過夜即可）。

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